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El recorrido de la exposición está estructurado en tres ámbitos expositivos: Antes de Madrid, Mayrit-Madrid y San Isidro.  

Antes de Madrid:

• Recibe al visitante un espacio dedicado al medio ambiente en el que vivieron los primeros pobladores de los valles madrileños, donde se exhibe una impresionante colección de restos de elefantes, rinocerontes, mamuts y otras especies hoy extinguidas.
• El siguiente apartado, dedicado a los “Cazadores-Recolectores”, presenta numerosos restos de las herramientas líticas utilizadas por estos nómadas para cazar y trabajar, en definitiva para el aprovechamiento de los recursos naturales. Se muestra igualmente la evolución tecnológica lograda en la talla de las piedras con las que se fabricaron esos útiles.
• A continuación, se presenta el desarrollo de las “Sociedades productoras”. El avance en el control del medio natural produjo importantes transformaciones en la sociedad. La sedentarización, ligada a la domesticación de animales y a la aparición de la agricultura,  conllevó una organización social más compleja, con la aparición de poblados y la clara presencia de creencias religiosas, manifestadas en los rituales funerarios. Los importantes avances  tecnológicos acaecidos, como la nueva forma de trabajar la piedra, pulimentándola, el descubrimiento de la cerámica, la aparición de la metalurgia quedan igualmente recogidos.
• “Entrando en la Historia”  es el siguiente apartado. En él se muestran los importantes cambios habidos en la sociedad y las tecnologías del primer milenio a. de C.: los poblados en alto, el rito de la incineración en urnas, la aparición de las necrópolis como nuevos espacios separados de los espacios habitados, la metalurgia del hierro o la invención de la rueda.
• En “Bárbaros y romanos”  se recoge la romanización del territorio de Madrid y el fin de la Antigüedad. Se exponen aquí, junto a otros yacimientos, restos de la villa romana de Villaverde Bajo, en la que se alcanzó un grado de refinamiento notable a juzgar por los mosaicos y pinturas, las esculturas, las cerámicas y los delicados vidrios. Igualmente se exhiben ajuares de cementerios visigodos que ilustran la forma de vida de estos nuevos habitantes.

Mayrit-Madrid:

• En estas salas se plantea la historia de Madrid desde su fundación, a mediados del siglo IX por los musulmanes, hasta la instalación permanente de la Corte. Asimismo se plasma el desarrollo urbanístico de la ciudad que fue rodeada por sucesivas murallas y cercas, islámicas y cristianas, y el gran crecimiento que experimentó la villa desde su conversión en capital de un imperio universal.
• Las piezas de las vitrinas nos dan idea de la vida cotidiana de los moradores, de los diferentes objetos utilizados habitualmente, en el ocio, para el adorno o de la importancia y presencia de la religión en numerosos aspectos.  Destaca la reconstrucción de un arco del claustro primitivo del monasterio de Los Jerónimos y  los cenotafios de Francisco Ramírez de Madrid “El Artillero” y Beatriz Galindo “La Latina”, que muestran la importancia de estos singulares  personajes en el Madrid del momento.

San Isidro:

• Este tercer ámbito está dedicado enteramente al santo madrileño y a su mujer Santa María de la Cabeza. Se muestran diferentes obras en las que se reflejan los milagros a él atribuidos.  La iconografía tradicional con la que se representa la figura de este labrador se refleja en las pinturas y esculturas expuestas.  Son de gran interés las pinturas al temple que realizó Zacarías González Velázquez, en 1789,  para la bóveda de la Capilla y el llamado “Pozo del milagro”, en el que San Isidro, según la tradición salvó de morir ahogado a su hijo haciendo subir milagrosamente el agua hasta el brocal.

Patio renacentista, Almacén Visitable y Jardín Arqueobotánico:

• El museo cuenta además con otros espacios destacables. El Patio renacentista del siglo XVI, un almacén visitable en el que se expone una gran cantidad de restos arqueológicos y paleontológicos de yacimientos de Madrid y con un jardín en el que están presentes plantas documentadas en el Madrid medieval.